IPTG (isopropil-β-D-tiogalactoside) nyaéta analog tina substrat β-galaktosidase, anu gampang diinduksi. Dina induksi IPTG, induser tiasa ngabentuk kompleks sareng protéin represor, sahingga konformasi protéin represor robih, sahingga teu tiasa digabungkeun sareng gén target, sareng gén target diekspresikeun sacara efisien. Janten kumaha konsentrasi IPTG kedah ditangtukeun nalika ékspérimén? Naha langkung ageung langkung saé?
Mimitina, hayu urang pahami prinsip induksi IPTG: operon laktosa (unsur) E. coli ngandung tilu gén struktural, Z, Y, sareng A, anu masing-masing ngodekeun β-galaktosidase, permease, sareng asetiltransferase. lacZ ngahidrolisis laktosa jadi glukosa sareng galaktosa, atanapi jadi allo-laktosa; lacY ngamungkinkeun laktosa dina lingkungan nembus mémbran sél sareng lebet kana sél; lacA mindahkeun gugus asetil tina asetil-CoA ka β-galaktosida, anu ngalibatkeun ngaleungitkeun pangaruh Toksik. Salian ti éta, aya runtuyan operasi O, runtuyan awal P sareng gén pangaturan I. Kode gén I nyaéta protéin represor anu tiasa ngabeungkeut kana posisi O tina runtuyan operator, supados operon (meta) direpresi sareng dipareuman. Aya ogé situs pangiket pikeun situs pangiket protéin aktivator gén katabolik-CAP di hulu runtuyan inisiasi P. Runtuyan P, runtuyan O sareng situs pangiket CAP babarengan ngawangun daérah pangaturan operon lac. Gén pangkode tina tilu énzim diatur ku daérah pangaturan anu sami pikeun ngahontal éksprési produk gén anu terkoordinasi.
Upami teu aya laktosa, operon lac (meta) aya dina kaayaan represi. Dina waktos ieu, represor lac anu diekspresikeun ku runtuyan I dina kadali runtuyan promotor PI ngabeungkeut kana runtuyan O, anu nyegah RNA polimérase ngabeungkeut kana runtuyan P sareng ngahalangan inisiasi transkripsi; nalika laktosa aya, operon lac (meta) tiasa diinduksi Dina sistem operon (meta) ieu, induser anu saleresna sanés laktosa sorangan. Laktosa lebet kana sél sareng dikatalisis ku β-galaktosidase pikeun dirobih janten allolaktosa. Anu terakhir, salaku molekul induser, ngabeungkeut kana protéin represor sareng ngarobih konformasi protéin, anu nyababkeun disosiasi protéin represor tina runtuyan O sareng transkripsi. Isopropylthiogalactoside (IPTG) gaduh pangaruh anu sami sareng allolaktosa. Éta mangrupikeun induser anu kuat pisan, anu henteu dimetabolisme ku baktéri sareng stabil pisan, janten seueur dianggo di laboratorium.
Kumaha nangtukeun konsentrasi IPTG anu optimal? Candak conto E. coli.
Galur E. coli BL21 anu direkayasa sacara genetik anu ngandung pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasi kana média cair LB anu ngandung 50μg·mL-1 Amp, teras dibudidayakeun sapeuting dina suhu 37°C. Kultur di luhur diinokulasi kana 10 botol média cair LB seger 50mL anu ngandung 50μg·mL-1 Amp dina babandingan 1:100 pikeun kultur ékspansi, sareng nalika nilai OD600 nyaéta 0,6~0,8, IPTG ditambahkeun kana konsentrasi ahir. Nyaéta 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Saatos induksi dina suhu sareng waktos anu sami, 1 mL larutan baktéri dicandak tina éta, teras sél baktéri dikumpulkeun ku cara sentrifugasi sareng dikenakeun SDS-PAGE pikeun nganalisis pangaruh konsentrasi IPTG anu béda-béda kana éksprési protéin, teras pilih konsentrasi IPTG kalayan éksprési protéin panggedéna.
Saatos ékspérimén, bakal kapanggih yén konsentrasi IPTG henteu ageung. Ieu kusabab IPTG ngagaduhan toksisitas anu tangtu pikeun baktéri. Ngaleuwihan konsentrasi ogé bakal maéhan sél; sareng sacara umum, urang ngarepkeun yén langkung seueur protéin leyur anu diekspresikeun dina sél, langkung saé, tapi dina seueur kasus nalika konsentrasi IPTG teuing luhur, seueur inklusi bakal kabentuk. Awak, tapi jumlah protéin leyur turun. Ku alatan éta, konsentrasi IPTG anu paling cocog sering sanés langkung ageung langkung saé, tapi langkung handap konsentrasina.
Tujuan induksi sareng budidaya galur anu direkayasa sacara genetik nyaéta pikeun ningkatkeun hasil protéin target sareng ngirangan biaya. Éksprési gén target henteu ngan ukur kapangaruhan ku faktor galur sorangan sareng éksprési plasmid, tapi ogé ku kaayaan éksternal anu sanés, sapertos konsentrasi inducer, suhu induksi sareng waktos induksi. Ku alatan éta, sacara umum, sateuacan protéin anu teu dipikanyaho diékspresikeun sareng dimurnikeun, langkung saé nalungtik waktos induksi, suhu sareng konsentrasi IPTG pikeun milih kaayaan anu pas sareng kéngingkeun hasil ékspérimén anu pangsaéna.
Waktos posting: 31 Désémber 2021