IPTG (isopropil-β-D-thiogalactoside) nyaéta analog substrat β-galaktosidase, anu kacida induksi.Dina induksi IPTG, inducer tiasa ngabentuk kompleks sareng protéin repressor, supados konformasi protéin repressor dirobih, ku kituna henteu tiasa digabungkeun sareng gén target, sareng gén target dikedalkeun sacara éfisién.Janten kumaha kedahna konsentrasi IPTG ditangtukeun nalika percobaan?Naha langkung ageung langkung saé?
Kahiji, hayu urang ngarti prinsip induksi IPTG: E. coli's laktosa operon (elemen) ngandung tilu gén struktural, Z, Y, jeung A, nu encode β-galactosidase, permease, sarta acetyltransferase, masing-masing.lacZ menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, atau menjadi alo-laktosa;lacY ngamungkinkeun laktosa di lingkungan ngaliwatan mémbran sél jeung asup kana sél;lacA mindahkeun gugus asetil tina asetil-KoA ka β-galaktosida, anu ngalibatkeun ngaleungitkeun efek toksik.Sajaba ti éta, aya runtuyan operasi O, runtuyan dimimitian P jeung gén pangaturan I. Kode gén I nyaéta protéin repressor nu bisa ngabeungkeut posisi O tina runtuyan operator, ku kituna operon (meta) repressed jeung dipareuman.Aya ogé situs ngariung pikeun aktivator gén katabolik protéin-CAP mengikat situs hulu tina sekuen initiating P. Sekuen P, runtuyan O jeung situs mengikat CAP babarengan mangrupakeun wewengkon pangaturan operon lac.Gén coding tina tilu énzim diatur ku daérah pangaturan anu sami pikeun ngahontal éksprési produk gén anu koordinasi.
Dina henteuna laktosa, lac operon (meta) aya dina kaayaan represi.Dina waktu ieu, repressor lac dikedalkeun ku runtuyan I dina kadali urutan promoter PI ngiket kana runtuyan O, nu nyegah RNA polimérase ti ngariung ka runtuyan P sarta ngahambat inisiasi transkripsi;lamun laktosa hadir, lac operon (meta) bisa ngainduksi Dina sistem operon (meta), nu inducer nyata lain laktosa sorangan.Laktosa masuk ke dalam sel dan dikatalisis oleh β-galaktosidase untuk diubah menjadi alolaktosa.Panungtungan, salaku molekul inducer, ngabeungkeut protéin repressor sarta ngarobah konformasi protéin, nu ngabalukarkeun disosiasi protéin repressor tina runtuyan O jeung transkripsi.Isopropylthiogalactoside (IPTG) memiliki efek yang sama dengan alolaktosa.Éta mangrupikeun inducer anu kuat pisan, anu henteu dimetabolisme ku baktéri sareng stabil pisan, janten seueur dianggo di laboratorium.
Kumaha nangtukeun konsentrasi optimal IPTG?Candak E. coli sabagé conto.
Galur E. coli BL21 anu direkayasa genetik ngandung pGEX rékombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasikeun kana médium cair LB anu ngandung 50μg·mL-1 Amp, sarta dikultur sapeuting dina suhu 37°C.Budaya luhur ieu inoculated kana 10 botol 50mL seger sedeng cair LB ngandung 50μg · mL-1 Amp dina nisbah 1:100 pikeun budaya ékspansi, sarta lamun nilai OD600 éta 0.6 ~ 0.8, IPTG ieu ditambahkeun kana konsentrasi ahir.Éta 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Saatos induksi dina suhu anu sami sareng waktos anu sami, 1 ml larutan baktéri dicandak ti dinya, sareng sél baktéri dikumpulkeun ku sentrifugasi sareng dilebetkeun kana SDS-PAGE pikeun nganalisis pangaruh konsentrasi IPTG anu béda dina éksprési protéin, teras. pilih konsentrasi IPTG kalawan éksprési protéin pangbadagna.
Saatos percobaan, éta bakal kapanggih yén konsentrasi IPTG teu saloba mungkin.Ieu kusabab IPTG gaduh karacunan anu tangtu pikeun baktéri.Ngalangkungan konsentrasi ogé bakal maéhan sél;jeung umumna disebutkeun, urang miharep yén protéin leuwih leyur dinyatakeun dina sél, nu hadé, tapi dina loba kasus lamun konsentrasi IPTG teuing tinggi, jumlah badag tina citakan bakal kabentuk.Awak, tapi jumlah protéin larut turun.Ku alatan éta, konsentrasi IPTG anu paling cocog sering henteu langkung ageung langkung saé, tapi langkung handap konsentrasina.
Tujuan induksi sareng budidaya galur anu direkayasa genetik nyaéta pikeun ningkatkeun ngahasilkeun protéin target sareng ngirangan biaya.Éksprési gén target henteu ngan ukur kapangaruhan ku faktor galur sorangan sareng ekspresi plasmid, tapi ogé ku kaayaan éksternal anu sanés, sapertos konsentrasi inducer, suhu induksi sareng waktos induksi.Ku alatan éta, sacara umum, sateuacan protéin anu teu dipikanyaho dikedalkeun sareng dimurnikeun, langkung saé diajar waktos induksi, suhu sareng konsentrasi IPTG pikeun milih kaayaan anu pas sareng kéngingkeun hasil ékspérimén anu pangsaéna.
waktos pos: Dec-31-2021